1 引言

　　我國紡織印染行業(yè)日產(chǎn)3×106~4×106 m3印染廢水，占整個(gè)工業(yè)廢水的35%，但印染廢水回用率不足10%(張斌等，2011).大量未經(jīng)處理的印染廢水直接排放到環(huán)境中，導(dǎo)致系列嚴(yán)重的環(huán)境污染問題.印染廢水較高的COD值和BOD值將大量消耗水體中的溶解氧，影響水環(huán)境中生物的生存;對水體動(dòng)物具有直接的致死、致畸毒性作用;此外，還會(huì)導(dǎo)致水體濁度升高，影響水生植物的光合作用，繼而改變局部水體生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈.

　　印染廢水的處理工藝，從傳統(tǒng)的理化處理工藝，逐漸發(fā)展出物理-生物處理工藝或化學(xué)-生物處理工藝，生物法處理工藝和酶法處理工藝.基于白腐菌及其產(chǎn)生的漆酶開發(fā)出的脫色工藝，是當(dāng)今生物法或酶法處理印染廢水的主流工藝(張曉昱等，2006;詹琪等，2014).然而，漆酶的催化活性高度依賴某些氧化還原介質(zhì)(如1-hydroxybenzotriazole，HBT等)，因此在實(shí)際應(yīng)用過程中，漆酶介導(dǎo)的脫色工藝，常常須向反應(yīng)體系中加入各種氧化還原介質(zhì)，以提高漆酶的脫色效果.上述介質(zhì)的加入，在增加企業(yè)生產(chǎn)成本的同時(shí)，還導(dǎo)致對環(huán)境的二次污染.

　　強(qiáng)氧化劑過氧乙酸，在降解環(huán)境污染物方面，具有良好的使用效果，但過氧乙酸作為一種易爆的危險(xiǎn)化學(xué)品，大規(guī)模制備、貯存及運(yùn)輸條件苛刻，對一般企業(yè)而言，存在較高的難度.以乙酸乙酯和過氧化氫為底物，利用過水解酶(Perhydrolase)催化合成過氧乙酸(圖 1)，具有較好的安全性和易操控性.酶法催化合成過氧乙酸耦合過氧乙酸(原位)氧化各類底物的酶法-化學(xué)聯(lián)合催化工藝，已在醫(yī)療廢水的處理、環(huán)氧化合物的合成、油脂深加工、木質(zhì)素降解等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用效果和前景.本文報(bào)道本實(shí)驗(yàn)室自主制備的過水解酶酶法催化合成過氧乙酸及其原位氧化活性艷藍(lán)KN-R(Remazol Brilliant Blue KN-R，RBBR)的脫色工藝.

?圖 1 過水解酶催化合成過氧乙酸的方程式?

　　2 材料與方法

　　2.1 化學(xué)試劑及產(chǎn)酶菌株

　　活性艷藍(lán)KN-R購自天津希恩思生化科技有限公司;2-氯-5，5-二乙基-1，3-環(huán)己二酮(Monochlorodimedone，MCD)購自Alfa Aesar-A Johnson Matthey Company;乙酸乙酯、溴化鈉和過氧化氫均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HisTrap HP(5 mL)購自GE Healthcare公司;標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)Marker購自寶生物工程(大連)有限公司.其他試劑均為市售分析純.

　　攜帶過水解酶編碼基因的重組Escherichia coli BL21(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，卡那霉素抗性.

　　2.2 過水解酶的制備

　　取E. coli BL21(DE3)重組菌株甘油管保藏菌液接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中(含50 μg · mL-1卡那霉素)，37 ℃過夜培養(yǎng)，活化菌種.將活化后的菌種轉(zhuǎn)接到200 mL LB液體培養(yǎng)基中(含50 μg · mL-1卡那霉素，1 L三角瓶)，30 ℃培養(yǎng)至 OD600達(dá)到0.6~0.9.向培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為1 mmol · L-1，誘導(dǎo)過水解酶基因的表達(dá).16 h后離心收集菌體.菌體重懸于pH 7.4，20 mmol · L-1 NaH2PO4-Na2HPO4，20 mmol · L-1咪唑，500 mmol · L-1 NaCl的緩沖溶液中，超聲裂解細(xì)胞.細(xì)胞裂解液10625 × g離心10 min，收集上清，用0.22 μm超濾膜過濾后作為粗酶液進(jìn)行純化.

　　以0.5 mL · min-1的上樣速度將粗酶液樣品加到HisTrap HP層析柱中，先用上樣緩沖溶液(pH 7.4，含20 mmol · L-1 Na2HPO4-NaH2PO4，20 mmol · L-1 咪唑，500 mmol · L-1氯化鈉)洗脫10個(gè)柱體積，再用洗脫液(pH 7.4，含20 mmol · L-1 Na2HPO4-NaH2PO4，500 mmol · L-1咪唑，500 mmol · L-1氯化鈉)以1 mL · min-1的流速線性梯度洗脫層析柱60 min.以3 mL · 試管-1分部收集洗脫液，分別通過酶活測定和SDS-PAGE電泳檢測洗脫液，收集具有過水解酶酶活的洗脫液，合并，再用pH 7.4，50 mmol · L-1 Na2HPO4-NaH2PO4的緩沖溶液平衡.

　　2.3 蛋白質(zhì)濃度的測定及酶活性的測定

　　過水解酶的純度及相對分子量采用SDS-PAGE檢測，分離膠濃度為12%.純化后的蛋白質(zhì)濃度的測定采用Bradford法進(jìn)行測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

　　過水解酶酶活的測定參照Yin和Kazlauskas(2012)的方法進(jìn)行，具體反應(yīng)體系如下：pH7.4，20 mmol · L-1 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中，依次加入終濃度為817.16 mmol · L-1的乙酸乙酯，149 mmol · L-1的溴化鈉，適量的酶液，0.047 mmol · L-1 MCD和0.01 mol · L-1過氧化氫，40 ℃下反應(yīng)5 min.在上述條件下，每min減少1 μmol MCD所需要的酶量，定義為1個(gè)酶活單位(U)(在此條件下，ε290= 2.03×104 L · mol-1 · cm-1).

　　2.4 活性艷藍(lán)KN-R最大吸收光譜的測定

　　用 UV-2600 型紫外可見分光光度計(jì)對70 mg · L-1的RBBR在可見光波段(400~800 nm)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，檢測RBBR的最大吸收波長λmax.在最大吸收波長λmax下測定并繪制RBBR濃度對吸光度Abs的標(biāo)準(zhǔn)曲線(RBBR濃度范圍：10~180 mg · L-1).

　　2.5 活性艷藍(lán)KN-R的脫色試驗(yàn)和脫色率的計(jì)算

　　脫色基準(zhǔn)反應(yīng)體系總體積為5 mL，反應(yīng)時(shí)間為6 h，反應(yīng)體系的緩沖溶液為20 mmol · L-1的磷酸氫二鈉-檸檬酸，反應(yīng)溫度為室溫(26~28 ℃).基準(zhǔn)反應(yīng)體系為：20 mmol · L-1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，80 mg · L-1的RBBR，3.0 U · 反應(yīng)-1的過水解酶添加量、0.8 mol · L-1的乙酸乙酯、0.01 mol · L-1的過氧化氫.

　　在單因子實(shí)驗(yàn)中，分別改變體系中的某一因子，而其他因子不變，以此考察pH、過水解酶添加量、染料濃度、乙酸乙酯與過氧化氫的摩爾比率等對脫色效果的影響.

　　RBBR脫色率的計(jì)算公式：脫色率(%)=(C0-Ct)/C0×100%，C0、Ct分別表示初始時(shí)刻和反應(yīng)終止后，反應(yīng)體系中的RBBR濃度.采用高溫滅活后的過水解酶作為對照組.實(shí)驗(yàn)組脫色率數(shù)據(jù)均為減去對照組脫色率后的數(shù)值，對照組和實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，并計(jì)算均方差.

　　2.6 正交優(yōu)化試驗(yàn)

　　根據(jù)上述單因子試驗(yàn)獲得的初步結(jié)果，進(jìn)行四因子三水平的正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化過水解酶對RBBR的脫色工藝.

　　2.7 活性艷藍(lán)脫色動(dòng)力學(xué)及放大實(shí)驗(yàn)

　　在正交實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)脫色條件下，分別測定不同處理時(shí)間對染料脫色效果的影響，測定過水解酶催化RBBR脫色的動(dòng)力學(xué)曲線.

　　在最優(yōu)脫色條件下，將脫色體系放大到250 mL(50倍放大)，檢測過水解酶催化的脫色效果.

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 過水解酶的純化及比活力測定

　　經(jīng)過HisTrap HP層析柱純化后的過水解酶SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖 2所示.電泳結(jié)果顯示為單一條帶，分子量大小為28 kDa，與預(yù)期大小一致.酶活測定表明，該過水解酶比活力為7.53 U · mg-1，高于已報(bào)道的其他過水解酶的比活力.

?圖 2 過水解酶的SDS-PAGE電泳分析?

　　3.2 染料RBBR的最大吸收波長測定

　　RBBR的最大吸收波長測定結(jié)果如圖 3所示.在595 nm處，染料RBBR有最大吸收峰，與Enayatzamir 等(2009)報(bào)道的最大吸收波長一致.在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中，均以595 nm作為檢測波長.RBBR的濃度在10~180 mg · L-1范圍內(nèi)，吸光度Abs與RBBR濃度呈良好的線性關(guān)系.

?圖 3 染料RBBR的吸收波長掃描圖?

　　3.3 不同因子對過水解酶脫色效果的影響

　　本實(shí)驗(yàn)使用的比色皿體積為5 mL，為方便后續(xù)檢測，確定了5 mL反應(yīng)體積的基準(zhǔn)反應(yīng)體系.為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果在后續(xù)實(shí)際應(yīng)用過程中具有指導(dǎo)價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溫度選擇室溫(福州地區(qū)常平均溫度在25℃左右).參照過水解酶酶活測定體系中的底物濃度設(shè)定基準(zhǔn)反應(yīng)體系中的乙酸乙酯和過氧化氫的初始濃度.在活性艷蘭KN-R標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)(中間濃度區(qū)段)，作為基準(zhǔn)反應(yīng)體系中活性艷蘭KN-R的初始濃度.為方便實(shí)驗(yàn)操作和比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以在一個(gè)工作日(8 h)的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，脫色率在80%~90%之間，確定基準(zhǔn)反應(yīng)體系中的初始加酶量(在前期調(diào)研其他酶制劑介導(dǎo)的染料脫色效果時(shí)，我們注意到大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的脫色率在80%~90%之間).

　　在5 mL基準(zhǔn)反應(yīng)體系中，緩沖溶液的pH、添加的酶劑量、乙酸乙酯與過氧化氫的摩爾比、RBBR濃度等因子對過水解酶脫色效果的影響如圖 4所示.

?圖 4 各種單一因子對RBBR脫色效果的影響(a. pH對脫色效果的影響；b. 過水解酶劑量對脫色效果的影響；c. 乙酸乙酯與過氧化氫摩爾比率對脫色效果的影響；d. RBBR濃度對脫色效果的影響)

　　在pH 3~5的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，脫色效果逐漸增強(qiáng);在pH=5時(shí)脫色率最高.隨著pH的進(jìn)一步提高，脫色效果逐漸降低(圖 4a).pH對過水解酶脫色效果的影響，是多重效應(yīng)共同作用的結(jié)果：①pH對過水解酶活性的影響.過水解酶的最適pH為6.0(實(shí)驗(yàn)室尚未發(fā)表數(shù)據(jù))，在pH 3~6的范圍內(nèi)，過水解酶的活性隨著pH的升高而升高;②pH對過氧化氫穩(wěn)定性的影響.過氧化氫在pH 3.5~4.5時(shí)最穩(wěn)定.作為過水解酶底物之一的過氧化氫的穩(wěn)定性，將直接影響到產(chǎn)物過氧乙酸的生成，從而間接影響到過水解酶的脫色效果;③pH對RBBR穩(wěn)定性的影響.在酸性或堿性pH條件下，中性的RBBR轉(zhuǎn)化為帶上正電荷或負(fù)電荷的離子型化合物，有助于RBBR的分解(Mahmoud et al., 2007).

　　在5 mL基準(zhǔn)反應(yīng)體系中，在0.5~25 U · 反應(yīng)-1的濃度范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)體系中酶劑量的增大，脫色效果逐漸增強(qiáng).在0.5~8 U · 反應(yīng)-1的濃度范圍內(nèi)，酶劑量與脫色率呈線性關(guān)系;當(dāng)酶劑量高于16 U · 反應(yīng)-1的范圍后，脫色率增高值極為有限，呈零級(jí)反應(yīng)(圖 4b).

　　在5 mL基準(zhǔn)反應(yīng)體系中，乙酸乙酯對過氧化氫的摩爾比率對RBBR的分解有較大的影響.當(dāng)摩爾比率低于40 ∶ 1時(shí)，RBBR的脫色率顯著降低(圖 4c).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)過水解酶對過氧化氫的親和力大于對乙酸乙酯的親和力.過氧化氫作為一種強(qiáng)氧化劑，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活.因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，構(gòu)建能耐受高濃度過氧化氫的過水解酶，有助于更好地大規(guī)模推廣過水解酶在印染廢水處理中的應(yīng)用.(2)反應(yīng)過程中，維持高濃度的乙酸乙酯是必要的.因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中，可考慮選用三酰甘油酯或二酰甘油酯替換乙酸乙酯，既可降低羧酸酯對過氧化氫的摩爾比，又有助于提高過水解酶在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性(在乙酸乙酯工藝中，產(chǎn)物中有乙醇生成;而三酰甘油酯或二酰甘油酯工藝中，產(chǎn)物為甘油).

　　在5 mL基準(zhǔn)反應(yīng)體系中，RBBR濃度在20~100 mg · L-1的濃度范圍內(nèi)，被分解掉的RBBR濃度隨初始濃度的增加而增加.RBBR濃度超過100 mg · L-1后，被分解掉的RBBR濃度增速減緩，呈零級(jí)反應(yīng)態(tài)勢(圖 4d).

　　3.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過水解酶脫色工藝

　　對反應(yīng)體系的pH、加酶量、乙酸乙酯與過氧化氫的摩爾比率和RBBR濃度4個(gè)因子進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表 1)表明：①對RBBR脫色率影響大小依次為B>D>C>A，即過水解酶劑量>RBBR濃度>乙酸乙酯與過氧化氫的摩爾比率>反應(yīng)體系的pH;②最優(yōu)組合為A2B3C2D1，即反應(yīng)體系的pH 5.0，加酶量為20 U · 反應(yīng)-1，乙酸乙酯對過氧化氫的摩爾比率為40 ∶ 1和RBBR濃度為80 mg · L-1.在最優(yōu)條件下，在5 mL反應(yīng)體系中進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，RBBR脫色率為81.11%.

?表 1 RBBR脫色的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)結(jié)果及分析

　　3.5 過水解酶脫色動(dòng)力學(xué)測定

　　在5 mL反應(yīng)體系中，過水解酶脫色動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖 5所示.在反應(yīng)的初始階段，具有極快的脫色速度(在反應(yīng)的初始30 min，體系中超過67%的RBBR被降解);隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，乙酸乙酯、過氧化氫及RBBR濃度逐漸降低，導(dǎo)致脫色率增速逐漸減緩.24 h后脫色率達(dá)到91.96%.RBBR的氧化脫色動(dòng)力學(xué)符合兩相指數(shù)衰減(Two phase exponential decay)模型(Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件Nonlinear Regression擬合結(jié)果)，脫色動(dòng)力學(xué)方程為：Y=12.32+65.82e(-9.61X)+21.86e(-0.2127X)(Y為脫色率，X為處理時(shí)間，R2=0.9986).

?圖 5 過水解酶原位合成過氧乙酸氧化RBBR脫色動(dòng)力學(xué)分析

　　3.6 250 mL反應(yīng)體系試驗(yàn)結(jié)果

　　在最優(yōu)工藝條件下，將反應(yīng)體系放大50倍(250 mL)后，進(jìn)行脫色試驗(yàn).以滅活的過水解酶作為對照組試驗(yàn);反應(yīng)24 h，測定RBBR的脫色率.放大體系試驗(yàn)的RBBR脫色效果如圖 6所示.和對照組相比，實(shí)驗(yàn)組具有非常明顯的脫色效果：溶液濁度(顏色)變淺，瓶底出現(xiàn)明顯的絮狀沉淀;24 h后RBBR的脫色率為84.55%，較5 mL反應(yīng)體系，略有下降，具體原因及機(jī)制還有待深入調(diào)查.

?圖 6 過水解酶在最適條件下在250 mL反應(yīng)系統(tǒng)中催化PBBR氧化脫色的效果

　　由于酶制劑的過水解活性(Perhydrolysis activity)屬于酶的催化混亂性活性(Promiscuous activity)，因此，常常需要加入過量的底物，以推動(dòng)反應(yīng)向正反應(yīng)反向進(jìn)行.按照優(yōu)化后的脫色體系，處理每噸污水需要加入274 mL的過氧化氫，而乙酸乙酯的量則達(dá)到反應(yīng)體系體積的4%(V/V).因此單就一個(gè)批次的污水處理而言，成本高于現(xiàn)有污水處理方法的運(yùn)行成本.但在實(shí)際操作過程中，處理后的污水，形成大量的絮狀沉淀物(圖 6).經(jīng)過簡單沉淀濾過后，只需向上清液中補(bǔ)加極少量的過氧化氫和乙酸乙酯，即可進(jìn)行下一批次的污水處理，脫色效果基本維持不變.在實(shí)驗(yàn)室階段，通過酶制劑的固定化技術(shù)，已實(shí)現(xiàn)6個(gè)批次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù)，后續(xù)論文將發(fā)表).事實(shí)上，利用三乙酸甘油酯(Glyceryl triacetate，GTA)替換乙酸乙酯，底物濃度可以進(jìn)一步降低到現(xiàn)有濃度的1/3.通過進(jìn)一步優(yōu)化工藝和酶制劑的固定化技術(shù)等措施，可實(shí)現(xiàn)底物的多批次循環(huán)利用，從而實(shí)現(xiàn)本技術(shù)路線的低成本運(yùn)行. 具體參見 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結(jié)論

　　1)利用過水解酶原位制備過氧乙酸進(jìn)行印染廢水(RBBR模型)處理，是完全可行的.通過酶促反應(yīng)(過氧乙酸的合成)和化學(xué)氧化反應(yīng)(過氧乙酸氧化RBBR脫色)耦合的兩階段反應(yīng)工藝，獲得了較好的脫色效果.在5 mL反應(yīng)體系中，6 h脫色率為81.11%;24 h脫色率為91.96%(由于對照組具有3%~5%的數(shù)值，因此實(shí)際脫色率已超過95%).

　　2)該工藝中，不同單一因子對RBBR脫色率的影響依次為：過水解酶劑量>RBBR濃度>乙酸乙酯與過氧化氫的摩爾比率>反應(yīng)體系的pH;最優(yōu)組合為：反應(yīng)體系的pH=5.0，加酶量為20 U · 反應(yīng)-1，乙酸乙酯對過氧化氫的摩爾比率為40 ∶ 1和RBBR濃度為80 mg · L-1.

　　3)在最優(yōu)條件下，250 mL反應(yīng)體系中，24 h后RBBR脫色率為84.55%;較5 mL反應(yīng)體系中的脫色率略有下降，具體原因及機(jī)制還有待深入調(diào)查.

　　致謝(Acknowledgement): 感謝國家留學(xué)基金管理委員會(huì)的資助;感謝瑞典皇家理工學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)系的Hult Karl教授、Martinelle Mats博士及Hendil-Forssell Peter博士在過水解酶研究方面的指導(dǎo).