1 引言
生物在線預警是指利用生物體生理、生化或行為對水環境變化產生的反應信息，對水質惡化趨勢的預測和突發事件的報警(Gerhardt et al., 2006).與其他生物監測儀器相比較，以監測魚類行為變化為基礎的水質生物在線預警系統具有更好的穩定性、可靠性、管理方便且運行費用低，是水源地、河流、污水處理廠等監測水質變化的最佳選擇(張金松等，2013).
環境中的污染物對幾乎所有的魚的行為都能夠產生影響，包括運動、繁殖、學習記憶能力、遷移、對掠食者的回避行為、捕食、社交等(Atchison et al., 1987).Ingram 等(2004)通過虹鱒魚的呼吸行為變化，如呼吸頻率和深度等，監測某紙漿和造紙廢水的毒性.Kang等(2009)以污染物暴露后青鱂魚出現急速游動、浮頭行動等異常行為作為判斷水質是否安全的依據.趙曉艷等(2010)則利用非接觸類電場感應斑馬魚的活躍強度、呼吸頻率等可迅速檢測到水體中有機磷農藥和抗生素的突發暴露.這些預警系統都是以1~2條魚為監測單元，因在單獨空間內其個體行為差異較大，使儀器的穩定性能較低.和個體相比，當魚處在群體中時可互相溝通并傳導信息，擁有更大的感知范圍，并且受到污染物刺激后，魚群會通過回避、急速運動、集群等一系列行為的改變來維持體內的穩定應對環境的變化(Schlenk et al., 2001).Chew等(2009)改變以個體魚為觀察對象的方式，通過捕捉20條魚在魚缸中的分布和活動，考察魚群的活躍水平、軌跡曲線密度、回避行為以及魚群中的“社交互動”等來評價魚類對污染刺激的行為反應.Barry(2011)的研究表明，在一定濃度的化學藥品的刺激下魚除了有快速游動的反應外，魚群的軌跡分布也發生明顯的變化，魚群更傾向于貼壁運動，同時分形維數也在不斷減小.因此，選擇合理的指標，魚類群體行為變化的連續監測，獲得更加全面的信息，可提高水質在線監測預警儀器的靈敏和穩定性.
本研究改變以個體魚為觀察對象的方式，通過捕捉5條斑馬魚在魚缸中的分布和活動，考察魚群的游動速度、高度、平均距離、分散度和不同區域停留時間等6個指標，綜合游動行為、通訊行為和分布區域的變化，用更加全面的信息反應水質突變狀況.實驗以正常水體中斑馬魚的群體行為變化為基礎，模擬氯氰菊酯和溴氰菊酯這兩種典型污染物質突發性聯合脅迫下，斑馬魚的行為響應來驗證監測指標選取的合理和有效性.
2 實驗材料和方法
2.1 斑馬魚的培養
實驗采用的斑馬魚(Zebrafish，Danio rerio)是國際標準化組織(ISO)推薦的標準實驗生物之一，在環境毒性評價的相關研究中應用廣泛.本實驗室對斑馬魚的飼養繁殖采用流水式，養殖用水為脫氯自來水，水溫為(28±1)℃，溶解氧為(6.5±0.2)mg · L-1，光照周期為10 h：14 h，以豐年蝦為食，每天投食2～3次.實驗時挑選魚齡為6~8個月，體長為(30±2)mm的斑馬魚，每組實驗用魚5條，雌雄比例為3：2，實驗前24 h不喂食.
2.2 實驗設計
2.2.1 斑馬魚急性毒性實驗
參照國際標準 ISO 7346 1-3《物質對淡水魚(斑馬魚)急性致死毒性的測定》，以1.5 g(魚)· L-1的要求，設置6個濃度梯度，每個濃度設3個平行，每組放10尾斑馬魚.實驗開始后第0、8、12、24 h觀察并記錄各容器實驗魚的存活情況.用鑷子夾魚的尾部，如無反應，即認為魚已經死亡，發現死魚后及時撈出.利用Graphpad Prism 5.0擬合劑量-效應曲線并計算得出24 h半致死濃度(LC50-24h).
2.2.2 斑馬魚魚群行為變化實驗
采用水質毒性在線檢測儀(RTB，深圳水務(集團)有限公司研制)進行斑馬魚的個體和群體行為變化的定量監測，如圖 1所示.在一個尺寸為400 mm×75 mm×300 mm的測試箱前設置一個CCD攝像頭，利用攝像追蹤系統和圖像分析技術，通過識別每條魚的特征輪廓來確定斑馬魚的運動方向與位置，并以12~16幀每秒的速度記錄標志點坐標通過軟件轉換計算出魚群的運動行為參數，包括游動行為(速度和高度)、通訊行為(平均距離和分散度)和區域分布情況(各區域停留時間占總時間的比例)，各指標定義如表 1所示.
圖 1 測量斑馬魚行為變化的實驗裝置設計圖
表1 監測指標的解析
實驗用水采用半靜態式流水實驗，控制進水流速為1 L · h-1，水溫為25 ℃，光照恒定，盡量減少人為、噪音等非水質因素的干擾.實驗共計運行3 h.其中，前1 h為空白實驗，記錄該組斑馬魚在正常水質狀況下的各監測指標的變化范圍，從第2 h開始時，即第60 min時加入化學物質，模擬實際水體突發性污染事件，記錄斑馬魚的行為變化.每組實驗的行為數據由5條魚的平均數求得，每個質量濃度進行3組平行，結果以3組平行實驗組的平均值顯示.
3 結果
3.1 急性毒性實驗
氯氰菊酯和溴氰菊酯對斑馬魚的24 h半致死濃度如表 2所示.結果表明，溴氰菊酯和氯氰菊酯對斑馬魚的LC50-24h分別為13.75×10-3 mg · L-1和69.61×10-3 mg · L-1，對斑馬魚的毒性大小為溴氰菊酯>氯氰菊酯.本研究以LC50-24h為1個毒性單位(1 TU)，在兩種化合物在各自0.25 TU(氯氰菊酯3.75 μg · L-1和溴氰菊酯15 μg · L-1)的聯合暴露下觀察斑馬魚的行為變化規律.
表2 氯氰菊酯和溴氰菊酯對斑馬魚的24 h急性毒性
3.2 斑馬魚游動行為的變化
如圖 2所示，第1 h正常水體暴露時，無外界刺激的干擾，斑馬魚的行為強度變化穩定，游動速度主要在30~60 mm · s-1之間均勻波動，平均速度為46.52 mm · s-1，標準差為9.08 mm · s-1;而高度在50~200 mm之間均勻波動，第1 h的平均高度值為124.60 mm，標準差為39.85 mm，如表 3所示.
圖 2 突發污染暴露下斑馬魚群體游動行為的變化
接觸到污染物的斑馬魚興奮異常，速度在30 min內持續增大，變化范圍明顯高于暴露前水平，在60~85 mm · s-1的范圍內波動，最大速度高達84.25 mm · s-1.隨后急劇下降，在15 min內降低至暴露前均值的42%左右，速度分布的標準偏差也是暴露前2倍，如表 3.最終速度維持在10~30 mm · s-1的水平并在后續的暴露中都維持在這一范圍內變化.而高度的變化稍微滯后于速度的突變，在暴露12 min后才明顯增高，并在持續的20 min內均值都高于200 mm，隨著暴露時間的增長，高度又逐漸恢復，第2 h的均值大小和暴露前相當，但標準偏差較大，即數據波動大.
表3 暴露前后斑馬魚游動行為數值分析
3.3 斑馬魚通訊行為的變化
受到污染物刺激后的魚群明顯失去原有的群體性，在剛接觸到污染物的10 min內有明顯的集群現象，平均距離和分散度短暫下降，然后又逐漸增大.魚群分布在暴露1 h后與暴露前差異顯著，平均距離均值從暴露前124 mm增加到178 mm，即增大43.5%，而分散度均值也由暴露前10%增加到22%，增大120%，如表 3所示.在第2 h的暴露中，平均距離和分散度的變化又有緩慢恢復至暴露前水平的趨勢，均值迅速下降，但標準差仍呈增大趨勢，即數據波動變大，如圖 3所示.
圖 3 突發污染暴露下斑馬魚社交行為的變化
3.4 斑馬魚的運動區域的分布
從圖 4明顯可以看出，正常水體中，斑馬魚的運動軌跡均勻分布在整個魚箱中，污染物暴露后，魚的活動范圍明顯減小，有逃離監測箱左下角(進水口)在右上角(出口處)游動的趨勢.為了更好的研 究魚的逃避行為，將這一趨勢進行量化，把魚箱等分為五行五列，分別統計每5 min內斑馬魚在每一區域的停留時間占總時間的比率，結果如圖 5所示.暴露前1 h斑馬魚在各區域內的分布基本穩定，其中在列1和行5區域內停留時間較多，為27%和25%左右，隨著暴露時間的延長，這兩個區域的停留時間逐漸縮短，而列5和行1內有明顯的增加趨勢，都增至25%左右.
圖 4 斑馬魚的魚群運動軌跡圖(a. 第30 min，b. 第90 min)
圖 5 斑馬魚暴露前后運動區域的分布
4 討論
正常水體在監測期間水質保持一致，因無外來刺激的干擾，斑馬魚魚群的行為變化穩定，游動速度、高度、平均距離和分散度等指標都在均值上下穩定波動，運動軌跡在檢測箱中均勻分布.由此可知，斑馬魚的游動行為在正常的水質狀況下呈現明顯的規律性，可用于水質突變條件下斑馬魚的行為比較，具有一定的可靠性.Gerhardt等(2002)證明在一定的水體環境下，利用不同頻率信號記錄的生物的游動、爬行、行走和呼吸等運動行為參數都在一個穩定范圍內變化.斑馬魚就被應用于該儀器中，空白暴露時穩定的行為變化趨勢為后續污染物暴露的反應提供了可靠的參照(趙曉艷等，2010).
利用對化學刺激品敏銳的感覺器官，斑馬魚可感知水體突變的狀況，表現出慌亂不安的過度活躍(Graham et al., 2004).游動速度在暴露過程中變化最為敏感和劇烈，前30 min內持續增大，變化區間由暴露前30~60 mm · s-1變化到60~85 mm · s-1.這種急速運動被稱為“回避反應”，是魚對水環境污染所產生的第一層次行為變化，其表現形式和所維持的時間長短受暴露化合物的種類及濃度的影響(任宗明等，2008).斑馬魚通過行為機制逐漸適應污染環境而導致的行為的變化，但隨著暴露時間的增長，污染物逐漸在斑馬魚體內積累，毒性最終爆發.暴露30 min后，斑馬魚的游動速度急劇下降.有研究表明，溴氰菊酯具有很強的神經毒性，可通過抑制腦突觸體膜上的ATP酶，使突觸后膜上的乙酰膽堿酯酶(AchE)等神經遞質大量聚集，從而引起腦AchE被抑制，而氯氰菊酯的暴露則可使魚體內產生大量的氧元素O2-，以致SOD酶活性被抑制，導致鰓、肝等組織的損傷(Soderlund et al., 2002).污染物對斑馬魚生理及組織等的影響導致其游泳速度最終維持在10~30 mm · s-1之間，僅是暴露前的1/2倍.
速度突然增大是魚類對環境變化刺激的第一反應，其次才是咳嗽頻率等呼吸行為的改變(Gerhardt et al., 2005).Kang等(2009)以“急速運動”和“浮頭行動”作為衡量青鱂魚運動異常的重要指標，指出污染物質對魚呼吸系統阻礙可導致游動深度的變化.但是，對呼吸系統的損傷要有一個毒物累積的過程，所以高度的反應會滯后于速度的變化.從魚群高度的變化可知，暴露12 min后游動高度明顯的增大，由暴露前的50~200 mm變化到150~270 mm.隨著暴露時間的延長，斑馬魚不斷通過自身的生理和行為調節適應了外界環境的壓力，游動高度在第2 h內逐漸恢復至暴露前水平，但標準差仍然繼續增大，即斑馬魚不斷調節適應的過程中行為的穩定性變差.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。
受到環境污染的刺激，魚類會在驚恐慌亂或靜止某個角落的狀態下使魚群失去原有的分布和通訊行為.接觸到污染物的前10 min內平均距離和分散度迅速下降，魚群出現短暫的集群現象.黃東龍等(2001)實證在鉛、鎘等重金屬的暴露下，斑馬魚在短時間內發生明顯的群聚性行為.這種行為也是一種對外界壓力的回避行為.隨著接觸時間的增長，魚群變得松散，群體性游動現象減弱，平均距離和分散度的波動區間明顯高于暴露前水平，分散度甚至為暴露前的2倍.Chew等(2009)證明在氯的刺激下，斑馬魚魚群失去原有的運動、分布和社交規律.進一步研究中還要再增加一些如平衡損失率、不規則轉彎等個體異常的監測指標，這樣個體和群體變化相結合，以獲得更加全面的信息.
隨著暴露時間的增長，斑馬魚不斷通過行為、代謝調節等適應環境的變化，游動高度、平均距離和分散度等逐漸恢復至暴露前水平，但仍選擇在濃度相對較低、接近水面的出水口附近游動.感知到水體中污染物的存在后，魚會往無污染或污染程度較輕的區域逃避(Clingerman et al., 2007).Gullick等(2003)使裝置形成不同的污染物濃度梯度，結果發現魚的大部分時間集中在潔凈水一端.雖然水箱中的水力流態是自下向上但進水口處的濃度還是高于出水處，魚可感知這些區域的差異，逃離濃度較高的列1和2的區域在行1和行2的停留時間明顯增加.
5 結論
斑馬魚是一種群游魚類，在水體中連續不斷的游動且可互相溝通，和個體相比集群之后能快速獲得更大的感知范圍，快速傳導信息，為水質在線預警提供更加全面、有效的信息.在溴氰菊酯和氯氰菊酯的聯合暴露的刺激下，斑馬魚的表現出快速不安的急速游動，速度由暴露前30~60 mm · s-1增至60~85 mm · s-1，而高度的變化滯后于速度12 min左右.在活動強度發生改變的同時，斑馬魚魚群的分散度和平均距離也不斷增大，分別增大43.6%和120.0%.但隨著暴露時間的增長，污染物也不斷在體內積累，最終導致游泳速度明顯下降且在污染濃度較低的區域停留時間增長，而高度、平均距離和分散度逐漸恢復至暴露前水平，但波動較大.利用速度、高度、平均距離、分散度、不同區域停留時間等6項可完整的描述這一過程的變化，全面及時的獲得魚群受污染物影響的行為變化特征，是用于水質預警的可靠指標.后續的研究應該考察斑馬魚魚群對其他污染物的行為反應，并通過計算和比較各指標權重和參與運算的方式，確定一個能夠綜合評價水質變化程度的參數.
