1 引言(Introduction)
多環芳烴(PAHs)是一種在海洋底泥中廣泛分布的疏水性有機污染物(HOCs)(董軍等，2006)，其釋放部分易被水生生物富集，從而影響底棲生物生存和經濟水產品質量.因此，監測生物體內及其暴露環境中的PAHs含量，對保障養殖區域環境及食品質量安全非常重要.傳統的通過測定生物體內殘留濃度(Cb，lip)來評價水產品質量及其食用風險的方法，需要使用大量溶劑，處理時間長且操作步驟繁瑣，同時受生物種類、性別、生長期和健康狀況等因素的影響，導致所獲得的數據差別較大(范元中等，2003)，從而影響評價結果的準確性.此外，也可通過監測養殖區域生物暴露環境中(包括生物棲息底泥及孔隙水)污染物的總濃度(陳珊等，2011)，并與底泥質量基準及水環境質量基準對比，評價養殖區域的環境質量及污染物對生物的潛在影響.但此種方法忽視了底泥污染物的生物有效性，監測結果與生物體內殘留濃度的相關性較差.
除部分直接以底泥作為食物的生物外，與底泥達到分配平衡的孔隙水中自由溶解態物質，才是底棲生物攝取的主要對象，是污染物在環境中遷移、分配及生物累積的驅動力，因此，底泥孔隙水中自由溶解態污染物濃度(Cfree)的測定越來越受到關注.但在底泥多介質體系中測定Cfree并不容易，傳統測定底泥孔隙水中Cfree的步驟包括離心、絮凝和測定.但由于孔隙水中沒有任何膠體存在，HOCs在運輸和保存過程中會產生不可忽視的損失.近年來，快速發展的以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料的固相微萃取技術能夠直接測定Cfree同時，PDMS具有與生物膜相似的性質，也可用于預測底棲生物對污染物的生物富集程度.因該技術具有新穎、廉價和使用方便等特點而越來越受到環境分析化學研究工作者的關注，并得以迅速發展.
本研究以養殖底泥中的PAHs為研究對象，以其在底泥中的生物有效性為切入點，采用以PDMS為材料的固相微萃取技術，當PDMS中PAHs的濃度(CPDMS)與底泥孔隙水中Cfree達到分配平衡時，依據PDMS具有與水生生物脂肪組織對HOCs相似的吸收和溶解特性，以濾食生活、代謝率低且對污染物的生物富集能力強(劉靜等，2009)的重要海水經濟底棲生物菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)為參照生物，建立代替傳統底棲生物用于監測底泥HOCs污染水平的 “虛擬生物”，同時建立PDMS與底泥有機碳標化污染物濃度間的定量關系模型，以期為基于固相微萃取的模擬生物法在養殖區域中有機污染物的監測提供理論基礎.
2 材料與方法
2.1 藥品與試劑
甲醇、二氯甲烷和正己烷均為色譜純(Sigma-Aldrich，USA);乙腈和丙酮均為色譜純(沃凱試劑，中國);氧化鋁、佛羅里硅土、層析硅膠(80~100目)、無水硫酸鈉與銅粉均為分析純(阿拉丁試劑，中國).氧化鋁、弗羅里硅土、硅膠和無水硫酸鈉使用前在馬弗爐中650 ℃烘6 h，置于干燥器中備用;銅粉參照EPA 3660A方法進行活化;聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)購自Specialty Silicone Products公司(USA)，使用前切成直徑為16 mm的薄片(厚度0.005 英寸，密度0.972 g · cm-3)，用15mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)溶液超聲清洗20 min，保存于甲醇/水(V/V，1 ∶ 1)溶液中備用.多環芳烴菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、苯并[k]熒蒽和苯并[a]芘等標準品(阿拉丁試劑，中國)購自上海晶純生化科技有限公司.
2.2 底泥采集、分析及加標老化
本實驗中所用的底泥采自上海洋山港潮間帶表層底泥，其有機碳和黑碳的含量分別為0.45%±0.03%和0.11%±0.01%(李娟英等，2015).本研究選取7種具有不同梯度辛醇-水分配系數(Kow)且檢出頻率較高的PAHs作為監測對象，并在海洋環境底泥風險評價分級的基礎上配置3個濃度梯度，分別為潛在生態風險效應低值(Effects Range Low，ERL，Long et al., 1995)的1、2和3倍.以丙酮為載體，將7種PAHs混合液加入底泥中，混勻，4 ℃避光保存，老化28 d.
2.3 生物累積實驗
菲律賓蛤仔購自上海市蘆潮港菜市場，在鹽度25±2和水溫(20±1)℃且連續曝氣的條件下馴養3周以上.馴養過程中光周期為16h:8h(光照:黑暗)，每天定時投加定量三角褐指藻進行喂養.菲律賓蛤仔的脂肪含量為0.51%±0.15%(測定方法參考GB/T5009.6—2003).
參照EPA方法(EPA 600/R-99/064)，稱取老化后的底泥約2 kg(濕重)放入5 L玻璃缸中，表面覆蓋4 L左右的人工海水(用海水素和蒸餾水配制).靜置1d后，于每個玻璃缸中放入馴養后活力強、個體大小相近的蛤仔25只(殼長(32±2)mm、殼高(12±2)mm).采用半靜水式方法(日換水1/2)(周永欣等，1989)進行累積實驗，暴露條件同馴養過程且期間不喂食.實驗設置1個空白，每個濃度梯度設置兩個平行，持續28 d.實驗結束后，將菲律賓蛤仔和底泥取出，冷凍干燥后磨碎備用.
2.4 固相微萃取測定底泥孔隙水中Cfree
根據Li等(2013)的計算方法，稱取400 g(濕重)底泥于1 L藍口瓶中，加入200 mL人工海水(底泥含水率控制在60%~70%)、氯化汞(底泥干重的0.15%)和1片潔凈的PDMS薄膜.置于振蕩器上連續振蕩28 d(20 ℃，200 r · min-1)以達到平衡.設置1個空白對照，每個濃度梯度設置2個平行.
實驗結束后，用鑷子將PDMS薄膜取出，用超純水洗凈后置于鋁箔上晾干，再用15 mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)超聲萃取2次，將2次萃取液混合后旋轉蒸發濃縮至2~3 mL，用柔和的氮氣吹至近干，乙腈定容至1 mL，待測.
2.5 PAHs的萃取、凈化及測定
本文中PAHs的萃取、凈化及測定參照本實驗室Li等(2015)的方法.簡述如下，稱取底泥樣品3 g或生物樣品1 g放入索氏提取器中，加100 mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)，于65 ℃水浴中回流萃取24 h.底泥萃取液過裝有4 g無水硫酸鈉、4 g氧化鋁和8 g中性硅膠的層析柱凈化;生物萃取液過裝有8 g佛羅里硅土和2 g銅粉的層析柱凈化.底泥及生物萃取液均用20 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，用柔和的氮氣吹至近干，乙腈定容至1 mL，待測.PAHs的測定采用Agilent7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀，DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱進行分離分析.氣相條件及質譜條件與Li等(2015)相同.底泥和菲律賓蛤仔樣品提取前，進行3個加標濃度梯度樣品的回收率實驗，回收率平均值為75%~120%，相對標準偏差為7%~12%.所有樣品的測定均設置全流程空白實驗及兩個平行.
3 結果與討論
3.1 固相微萃取模擬生物法用于底泥孔隙水中Cfree的測定
底泥孔隙水中PAHs總濃度(Cwater)可以通過底泥中PAHs總濃度(CS，OC)及底泥有機碳-水分配系數(KOC)計算得到(表 1).然而，Cwater包括Cfree和溶解性有機碳(DOC)結合態濃度(Allan et al., 2012)，但結合態污染物因其極性太強或者體積太大不能被生物體吸收，即不具有生物有效性.Hunter等(2009)的研究也表明，只有自由溶解態的分子才能夠穿過生物膜被生物吸收.與上述方法相比，固相微萃取PDMS中只富集自由溶解態的污染物(Mayer et al., 2003)，因此，可根據PDMS中污染物的濃度CPDMS和PDMS-水分配系數(KPDMS-w)計算孔隙水中的Cfree，從而更真實地反映孔隙水暴露環境中PAHs的生物有效性濃度.
表1 PAHs分配常數及底泥體系各相中PAHs的濃度
?以低濃度梯度底泥為例，表 1列出了PAHs的不同分配系數和底泥體系各相中PAHs的濃度.由表 1可知，7種PAHs的Cwater均大于Cfree.徐曉陽等(2010)使用土壤-水相分配系數(Kd)推測的Cwater比使用微萃取方法測得的Cfree大4~5倍，本實驗結果與之相似.這與Cwater中既包括自由溶解態的污染物，也包括DOC結合態污染物密切相關(Xia et al., 2013).此外，低環PAHs的Cwater比Cfree大1~2倍，而高環PAHs則大5~10倍，說明隨著PAHs環數和疏水性(辛醇-水分配系數Kow)的增加，高環PAHs更傾向于以DOC結合態而非自由溶解態的形式存在于孔隙水中，從而降低其生物有效性.因此，傳統使用Cwater評價養殖底泥孔隙水中PAHs暴露水平的方法，因忽視了生物有效性可能導致結果產生偏差.因此，使用以PDMS為材料的固相微萃取模擬生物法測定Cfree，為更好地評估底泥孔隙水中PAHs的真實暴露水平提供了替代方法.
3.2 固相微萃取模擬雙殼類生物體內PAHs的富集
底棲生物體內污染物殘留水平檢測是評價底泥中污染物生物有效性最直接有效的方法(周東星等，2014).由于PDMS基于生物有效性富集底泥中的污染物，因此，具有模擬養殖經濟底棲生物體內PAHs殘留的潛力.為了確定基于固相微萃取的模擬生物法是否可以模擬菲律賓蛤仔富集底泥環境中的PAHs，需要比較PDMS與菲律賓蛤仔富集底泥中污染物的途徑，并進一步建立兩者富集程度之間的定量關系.
3.2.1 菲律賓蛤仔與PDMS富集底泥中PAHs的途徑比較
生物富集系數(BAF)是生物富集最直觀的數字表達，BAF(L · kg-1)可用下式計算得到(Kraaij et al., 2003)：
BAF=Cb，lip/Cfree
式中，Cb，lip為生物體內脂肪標化的污染物含量(ng · g-1，以lipid計)，Cfree為孔隙水中自由溶解態污染物濃度(μg · L-1).
由于Kow是描述污染物在水相和有機相間分配特征的重要參數，且如果某化學物質在水生生物體內的代謝可忽略不計，則化學物質的Kow值越大，其在生物體內生物富集程度越高(胡霞林，2009).本研究中菲律賓蛤仔的BAF值隨著Kow的增大而增加(圖 1)，且lgBAF與lgKow成顯著線性相關(y=x-0.613(R2=0.92，r=0.96，p<0.01)).由于Kow表示化學物質在正辛醇相與水相間達到分配平衡時的濃度比(王翊如等，1999)，因而lgBAF與lgKow的顯著相關表明，底泥孔隙水中自由溶解態的PAHs在菲律賓蛤仔脂肪相和孔隙水相之間的分配也達到平衡.
同時，當自由溶解態的PAHs在PDMS相和孔隙水相之間分配達到平衡時，lgKPDMS(KPDMS=CPDMS/Cfree)與lgKow也成顯著線性相關(圖 1，y=x-0.691，R2=0.978，r=0.99，p<0.01).Porte等(1993)就貽貝、鯔魚及螃蟹對底泥相及水相中多氯聯苯富集的研究發現，對于鯔魚和螃蟹，底泥相暴露后的lgBAF與lgKow的斜率明顯大于水相暴露后lgBAF與lgKow的斜率，說明鯔魚及螃蟹在底泥暴露過程中，除了富集孔隙水中污染物，還攝取了部分顆粒結合態污染物;而貽貝在兩相暴露實驗中的所獲得的lgBCF與lgKow的斜率相同，表明暴露于底泥中貽貝體內的污染物主要來自孔隙水中的污染物.而本研究中lgBAF與lgKow的線性斜率和lgKPDMS與lgKow的線性斜率相當(圖 1)，表明菲律賓蛤仔與PDMS攝取底泥中PAHs的主要途徑類似.
圖1 lgKow與lgBAF和lgKPDMS的關系
3.2.2 菲律賓蛤仔與PDMS富集PAHs的相關性
為進一步探討PDMS在復雜體系中模擬菲律賓蛤仔生物富集PAHs的準確性，本研究測定了平衡時3個濃度梯度下PDMS中PAHs的濃度(CPDMS)與菲律賓蛤仔體內PAHs的濃度(Cb，lip)，并對兩組濃度進行了回歸及相關性分析(圖 2)，且通過定量計算得到Cb，lip約為CPDMS的1.0~1.5倍.該定量關系與其他研究者基于PDMS預測疏水性有機污染物(HOCs)在底棲無脊椎生物體內富集的定量關系有所差異，如Leslie等(2002)用PDMS預測搖蚊對底泥中PAHs富集的研究中得出Cb，lip≈8CPDMS.這種差異與受試生物種類有密切關系，不同生物體內脂肪含量不同，而脂肪含量是影響疏水性化學物質生物富集的主要因素(Geyer et al., 1994)，生物體內脂肪含量越大，生物富集程度越高.本研究中菲律賓蛤仔體內的脂肪含量僅為0.51%，與其他生物相比，脂肪含量較低(如搖蚊體脂含量為0.96%，河蜆體脂含量為2.37%);另外，生物體內PAHs的殘留濃度與污染物在生物體內可能會發生脂類代謝和生物轉化有關，如PAHs中苯并[a]芘會在沙蠶屬幼蟲體內發生轉化(Mcelroy et al., 1989).本實驗僅針對PAHs母體化合物開展研究，沒有將不同生物體內脂類代謝和生物轉化考慮在內.盡管如此，lgCPDMS與lgCb，lip呈顯著性相關，意味著基于固相微萃取技術的模擬生物法可以用于海洋雙殼類底棲生物體內PAHs母體化合物的殘留模擬，且考慮到成本、效率和大范圍推廣的因素，使用固相微萃取模擬海洋養殖區底泥污染物在底棲生物體內的富集殘留和檢測較傳統方法優勢明顯.
?圖2 lgCPDMS與lgCb，lip的關系
3.3 PDMS相與底泥相中PAHs濃度的相關性
上述討論表明，基于固相微萃取技術的模擬生物法不僅可以計算PAHs在底泥孔隙水中的Cfree，且與菲律賓蛤仔體內生物富集濃度存在顯著的相關性，如果能進一步建立和完善PDMS相與底泥相中PAHs濃度間相關關系，就可為基于固相微萃取的模擬生物法在養殖區域中的污染物的監測應用奠定基礎.
為此，本研究進行了3個濃度梯度下底泥中OC標化的PAHs濃度(CS，OC)與PDMS中PAHs濃度(CPDMS)的相關性研究(圖 3)，結果表明，PDMS中PAHs的濃度同樣與底泥中PAHs的濃度(y=0.758x-2.365，R2=0.65，r=0.83，p<0.01)間具有顯著相關性，且這種相關關系使得傳統CS，OC的總量測定結果可用于底泥污染物生物有效性評價，這對底泥質量標準制定及底泥暴露風險評價具有重大意義.本文中兩者間的定量關系為CS，OC≈5CPDMS，與Li等(2013)得出的CS，OC≈2CPDMS稍有不同，但共同點是污染物在底泥中的分配高于PDMS.原因是進入底泥中的污染物，分為快速解吸、慢速解吸和極慢速解吸3種存在狀態，甚至部分以不可逆解吸狀態存在，3種存在狀態下污染物的物理遷移能力、生物有效性及化學反應活性具有差異(Liu et al., 2011)，CS，OC為有機溶劑提取的污染物總濃度，而生物有效部分主要指可快速解吸的污染物，以PDMS為材料的固相微萃取法對污染物的獲取或濃縮過程完全基于化合物從化學勢或逸度高處(即外界環境基質)向化學勢或逸度低處(即采樣介質或吸附劑)的自動擴散(陳珊，2011)，其富集的PAHs以容易解吸部分為主，且大量研究表明，生物有效的HOCs主要來源于容易解吸的部分(胡霞林，2009;Reichenberg et al., 2006).因此，根據CS，OC評價底泥污染可能會過高估計底泥暴露環境中PAHs對底棲生物的危害.此外，相關關系之間的這種差異與底泥特性也有密切關系，如底泥OC含量、粒度分布及OC種類(如黑碳和煤)等(Cornelissen et al., 2005)也對PAHs的分配起至關重要的作用，也是今后本課題組將繼續深入研究的內容之一.盡管如此，CS，OC與CPDMS的顯著相關仍表明基于固相微萃取的模擬生物法可用于養殖區域底泥中PAHs的污染監測.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。
?圖3 lgCPDMS與lgCS，OC的關系
4 結論
1)以PDMS為材料的固相微萃取模擬生物法為準確測定底泥孔隙水中PAHs的Cfree提供了替代方法，Cfree低于Cwater，且環數越高，差異越大.Cfree能更好地反映底泥孔隙水中PAHs的暴露水平，為固相微萃取技術在環境監測中的應用奠定了基礎.
2)菲律賓蛤仔對PAHs的富集系數及PDMS-水分配系數均與辛醇-水分配系數呈顯著線性相關，且兩者的斜率相當，表明菲律賓蛤仔與PDMS攝取底泥中PAHs的途徑類似.
3)PDMS中PAHs濃度與菲律賓蛤仔體內殘留PAHs及底泥中OC標化的PAHs濃度之間均呈現顯著的相關性，定量關系分別為Cb，lip≈1.5CPDMS和CS，OC≈5CPDMS，表明基于固相微萃取的模擬生物法具有在養殖區域有機污染物監測中應用的潛力，但有機污染物在生物體內的轉化和底泥性質對監測應用的影響有待進一步研究.
